포레게네 주식회사.
중국 FOREGENE, 세계의 FOREGENE!
피벳 팁의 소독과 EP 튜브, 기타 등등.
1. 탈염수로 0.1%에게 (1/1000) DEPC (대단히 유독 물질을) 차려주고, 환기 푸드에서 주의깊게 그것을 사용하고, 빛으로부터 떨어진 4' Ｃ에 그것을 저장하세요 ;
DEPC 물은 DEPC로 대접받고 고온과 고압에 의해 멸균된 정제수입니다. RNA 가수분해효소, DN 분해 효소와 프로테이나제가 없기 위해 시험됩니다.
2. 피벳 팁과 EP 튜브를 0.1% DEPC에 넣고, 피벳 팁과 EP 튜브가 0.1% DEP으로 채워지는다는 것을 보증하세요.
3. 빛으로부터 보호하고 입지, 밤새 (12-24h)를 허용하세요
4. 팁과 EP 튜브를 포함하는 박스는 DEPC 내에 잠겨질 필요가 없습니다. 대략 팁 또는 EP 튜브에서 DEPC 바다를 제거한 후, 그것을 포장하고 싸세요.
5. 30 분인 121 도 섭씨
6. 180 도 섭씨가 여러 시간 (적어도 3 시간) 동안 마릅니다
기록 : a. DEPC를 취급할 때 웨어 라텍스 장갑과 마스크! 비 또는 없이 DEPC 소독, 130 Ｃ, 90 분 압력솥 (많은 실험실 고온 살균 2회)
RNA 추출 고찰
조직 rna 차단 실패의 2가지 핵심 현상
퇴보를 고려하는 조직에서의 RNA 퇴보와 잔여물 불순물의가 먼저 우리를 허용했고 왜 배양 세포로부터 추출된 RNA가 쉽게 떨어뜨려지지 않는지 봅니다. 현존하는 RNA 추출 반응제 모두가 신속히 RNA 가수분해효소를 억제하는 성분을 포함합니다. 용해물을 배양 세포에 더하고, 단순히 그것을 섞으시오 그러면 모든 셀은 완전히 용해물과 혼합될 수 있고 셀이 완전히 용해됩니다. 세포가 용해된 후, 용해물에서 유효성분은 바로 세포내 RNA 가수분해효소를 억제하고 따라서 RNA가 완전한 채로 남아 있습니다. 즉, 배양 세포가 쉽게 그리고 완전히 용해물과 접촉되기 때문에, 그들의 RNA는 쉽게 떨어뜨려지지 않습니다 ; 다른 한편으로는, 조직에서 세포가 빨리 용해물과 연락하도록 쉽지 않기 때문에 조직에서 RNA는 쉽게 떨어뜨려집니다. 충분한 접촉 때문에. 그러면 거기를 추측하는 것 RNA 활동을 억제하면서, 퇴보의 문제가 완전히 해결될 수 있는 동안 조직을 단일 세포로 전환하기 위한 방법이 있습니다.
액화질소 분쇄는 가장 효과적 그와 같은 방법입니다. 그러나, 특히 표본의 수가 클 때, 액화질소 밀링법은 매우 성가십니다. 이것은 차선책을 일으켰습니다 : 균질기. 어떻게 세포가 용해물과 접촉되기 전에 rna분해효소 활성이 억제되는지 문제를 고려하지 않지만, 조직 디스럽션의 자율이 세포내 RNA 가수분해효소가 RN을 떨어뜨리는 자율 보다 더 빠르게 있기를 균질기 방법은 오히려 기도합니다.
전기 호모게나이저의 효과가 더 좋고 유리 균질기의 효과가 가난하지만 일반적으로 균질기 방법은 퇴화 현상을 방지할 수 없습니다. 그러므로, 추출이 떨어뜨려지면, 원래 전기 호모게나이저는 액화질소로 갈래서 사용되어야 합니다 ; 원래 유리 균질기는 전기 호모게나이저로 변경되거나 직접적으로 액화질소로 제분되어야 합니다. 문제는 가능한 거의 100%입니다. 해결하세요.
후속 실험에 영향을 미치는 음란 잔여물 문제는 퇴보 보다 더 다양한 원인을 가지고 해결책이 상응하게 다릅니다. 결론적으로, 퇴보 또는 조직에서 잔류 불순물이 있다면 특별한 시험 재료를 위한 추출 방법 / 시약은 최적화되어야 합니다. 당신은 최적화를 위한 귀중한 샘플을 사용할 필요가 없습니다 : 당신은 시장으로부터 생선과 같은 약간의 소 동물에게 / 닭을 사주고 RNA 추출에 쓸 소재의 대응부와 단백질 추출 - 입, 복부와 소장 추출물과 그라인드를 위한 다른 부품을 잡을 수 있습니다.
추출된 RNA의 타겟 RNA는 다른 잇따른 실험을 위해 사용되고 그것의 품질 요구 사항이 다릅니다
cdna 라이브러리 구성은 효소 반응 억제제의 잔여물 없이 RNA 완전성을 요구합니다 ; 북부는 효소 반응 억제제 잔여물을 위해 더 높은 RNA 완전성과 더 낮은 요구조건이 요구됩니다 ; RT-PCR는 또한 높은 RNA 완전성을 요구하지 않지만, 효소 반응을 억제합니다. 잔여물 요구는 엄격합니다. 입력은 출력을 결정합니다 ; 목표는 최고 순도 RNA를 획득하는 것일 때마다, 그것은 사람들과 돈의 비용이 들 것입니다.
샘플의 수집 / 저장
샘플이 생명체 / 또는 원래 성장 환경을 남기고, 샘플에서 내인성 효소가 RNA를 떨어뜨리기 시작할 것이고, 저하율이 내인성 효소와 온도의 컨텐츠와 관련되는 후 요인이 퇴보에 영향을 미칩니다. 전통적으로, 거기는 완전히 내인성 효소 활성을 억제하기 위한 2가지 방식 일 뿐입니다 : 바로 용해물을 추가하고 완전히 그리고 신속히 균질화하세요 ; 작은 조각으로 절단하고 바로 액화질소에서 어세요. 양쪽 접근은 빠른 작동을 요구합니다. 후자가 모든 샘플에 적합한 반면에, 이전인 것 균질화하기 위해 단지 세포와 내인성 효소의 저함량과 조직에 적합하고 더 쉽습니다. 특히, 식물 조직, 간, 흉선, 췌장, 비장, 뇌, 지방, 근육 조직, 기타 등등이 진행되기 전에 가장 잘 액화질소에 의해서 동결됩니다.
샘플의 붕괴와 균질화
퇴보와 생산량 샘플 붕괴에 영향을 미치는 요인은 RNA의 완전하고 완전 방출을 위한 철저한 균질화를 위한 것입니다. 셀은 깨지는 것 없이 직접적으로 균질이 될 수 있습니다. 조직은 단지 깨진 후 균질이 될 수 있습니다. 그들이 균질이 될 수 있기 전에 효모와 박테리아는 상응하는 효소로 깨질 필요가 있습니다. 낮은 내생적 효소 함량과 더 쉬운 균질화와 조직은 균질기에 의해 용해물에서 한 번에 압도되고 균질이 될 수 있습니다 ; 식물 조직, 간, 흉선, 췌장, 비장, 뇌, 지방, 근육 조직과 다른 샘플, 그들이 내인성 효소에 또한 높거나, 쉽게 균질이 되지 않아서 조직 디스럽션과 균질화가 개별적으로 수행되어야 합니다. 붕괴의 가장 믿을 만하고 가장 생산적 방법은 액화질소로 정처없이 돌아다니고 있고 균질화의 가장 믿을 만한 방법이 전기 호모게나이저의 사용입니다. 액화질소로 정처없이 돌아다니는 것에 대하여 특수 노트 : 내인성 효소가 더 동결될 때 작용할 가능성이 많은 것처럼, 샘플은 전체 밀링 공정 동안 녹지 않아야 합니다.
용해물 중에서 선택
작전의 편익과 나머지 내생적 음란의 요인에 영향을 미치면서 일반적으로 사용된 괴사 용액은 거의 RNA 가수분해효소의 활동을 억제할 수 있습니다. 그러므로, 괴사 용액을 선택하는 핵심 사항은 정화 동작 방법과 결합하여 고려하는 것입니다. 한 예외가 있습니다 : 높은 내생적 효소 함량과 샘플은 내인성 효소를 비활성화시키기 위해 능력을 증가시키기 위해 페놀을 포함하는 용해물을 사용한다고 추천받습니다.
정화 동작 방법 중에서 선택
세포, 만족스런 결과와 같은 청정 표본을 위해 나머지 내생적 음란, 추출 속도에 영향을 미치는 요소는 가까이에 거의 모든 정화 동작 방법에 의해서도 획득될 수 있습니다. 그러나 많은 다른 샘플에게는, 특히 적당한 정화 동작 방법을 선택하는 원전, 간, 박테리아, 기타 등등과 같은 음란의 높은 수준과 그것들은 결정적입니다. 기둥 원심력 정화 동작 방법은 고속 채굴 속도를 가지고 있고, RNA의 차후 효소에 의한 반응에 영향을 미치는 음란을 효과적으로 제거할 수 있지만, 그러나 그것이 비쌉니다 (포레게네가 비용 효율적 장비를 제공할 수 있습니다, 더 많은 세부사항이 여기를 클릭합니다) ; 리크들 강우량과 같은, 경제적이고 고전적 정화 동작 방법을 이용하는 것 또한 만족스런 결과를 얻을 수 있지만, 그러나 작동 시간이 오랫동안 있습니다. .
3가지 원칙과 RNA 추출을 위한 8가지 관심
원칙 1 : 외인성 효소의 오염물을 끝내세요.
주기 1 : 엄밀하게 웨어 마스크와 장갑.
기록 2 : 실험에 연관된 원심 분리관, 팁 헤드들, 피펫 로드, 전기영동조와 실험적 벤치는 완전히의 처분하여야 합니다.
기록 3 : 실험, 특히 물에 연관된 시약 / 수용액은 있어야 합니다 rnase-프리.
원칙 2 : 내인성 효소의 활동을 차단하세요
기록 4 : 적절한 균질화법을 선택하세요.
기록 5 : 적절한 용해물을 선택하세요.
기록 6 : 표본의 기동량을 제어하세요.
원칙 3 : 당신의 추출 목적을 명백하게 하세요
기록 7 : 샘플의 최대 기동량에 접근하는 어떠한 분해질 시스템와도 함께, 추출 성공률은 날카롭게 떨어집니다.
기록 8 : 성공적 RNA 추출을 위한 단지 경제적 표준은 후속 실험에서 성공이고 양보하지 않습니다.
RNA 가수분해효소 오염을 얻는 톱10 근원들
1. 손가락이 외인성 효소을 얻는 첫 번째 소스여서 장갑은 자주 입혀지고 대체됩니다. 호흡이 또한 효소을 얻는 중요한 소스이기 때문에, 게다가 마스크는 또한 입혀져야 합니다. 장갑 마스크를 쓰는 부가 급부는 실험자를 보호하는 것입니다.
2. 피벳 팁, 원심 분리관, 피펫 - DEPC가 다룬 것처럼 그들이 표시될지라도, RNA 가수분해효소는 피벳 팁과 원심 분리관이 DEPC로 치료되어야 하도록 홀로 소독에 의해 비활성화시킬 수 없으세요. 목적 피펫을 사용하고 사용, 특히 로드 전에 75% 알코올 카튼 볼로 그것을 닦는 것은 최고입니다 ; 머리 제거제를 사용하지 않기 위해 게다가 확신하세요.
3. 식수 / 버퍼는 RNA 가수분해효소 오염이 없습니다.
4. 적어도 시험표는 75% 알코올솜 볼로 깨끗이 닦아야 합니다.
6. rna 샘플 RNA 추출 제품은 RNA 가수분해효소 오염의 흔적을 포함할 수 있습니다.
7. 플라스미드 추출 플라스미드 추출은 RNA를 떨어뜨리기 위해 종종 RNA 가수분해효소를 사용하고 나머지 RNA 가수분해효소가 프로테이나제 Ｋ에 의해서 소화되고 PCI에 의해 추출되어야 합니다.
8. RNA 저장은 그것이 RNA 가수분해효소의 액수가 바란 저온, 추적에 저장될지라도 RNA 퇴보를 야기시키세요. 술이 저온에 있는 효소력을 모두 억제하기 때문에, RNA의 장기 보존을 위한 최고의 해결책은 소금 / 알콜 서스펜션입니다.
9. 양이온 (Ca, Mg)가 이러한 이온을 포함할 때, 5 분 동안 80C 가열하는 것 RNA가 쪼개지게 할 것이며 만약 RNA가 가열될 필요가 있다면, 보호 솔루션이 킬레이트화제 (1mM 구연산나트륨, pH 6.4)를 포함할 필요가 있습니다.
10. 후속 실험에서 사용된 효소는 RNA 가수분해효소로 오염될 수 있습니다.
RNA 추출을 위한 10 팁
1 : 빨리 rna분해효소 활성을 예방하세요. 샘플은 빨리 수집 뒤에 동결되고 RNA 가수분해효소가 박리 동안 빠른 작동에 의해 비활성화시킵니다.
2 : 높은 리보자임 내용과 조직을 위한 적절한 추출 방법을 선택하고 지방 조직은 페놀을 포함하는 방법을 이용하도록 최고입니다.
3 : 예상 품질은 북부를 요구하고, cdna 라이브러리 구성이 높은 완전성을 요구하고, RT-PCR와 RPA (리보뉴클레아제 보호 분석)이 높은 완전성을 요구하지 않습니다. RT-PCR는 고순도 (효소 억제제 잔여물)을 요구합니다.
4 : 철저한 균질화는 생산량과 감량 퇴보를 향상시키는 것에게 키입니다.
5 : RNA 전기영동 탐지, 28S의 완전성을 확인하세요 : 18S = 2 : 1는 완전한 신호, 1입니다 : 1는 또한 대부분의 실험에 받아들여질 수 있습니다.
6 : 그것이 최고인 배열 분석인 RT-PCR를 위한 DNA의 이동은 DNA를 제거하기 위해 DN 분해 효소 I를 사용합니다.
7 : 외인성 효소의 오염물을 감소시키고 - 효소는 외부로부터 수입될 수 없습니다.
8 : 저농도 핵산을 집중할 때, 준석출 시약은 추가되어야 합니다. 그러나 효소와 DNA 오염물을 포함하는 동시 침전제를 방지하고.
9 : 완전히 RNA를 해산하고 필요한 경우, 5 분 동안 65C 가열하세요.
적당한 저장 방법
그것은 오랫동안 짧은 시간 동안 -20C에, 그리고 -80C에 저장될 수 있습니다. RNA 생산량을 향상시키는 것에 첫 번째 단계는 다른 샘플의 RNA 내용이 매우 다르다는 것을 깨닫는 것입니다. 뇌, 배, 신장, 폐, 흉선, 난소,와 같은 간, 췌장, 심장, 매체 대량 (0.05-2ug/mg)와 같은 높은 대량 (2-4ug/mg) 낮은 풍부 (<0>
1 : RN을 공개하기 위한 라이세 셀 - RNA가 공개되지 않으면, 생산량은 감소될 것입니다. 전기 균질화는 다른 균질화법 보다 더 잘 일하지만, 또한 액화질소 매싱, 효소 소화 (Lysozyme/Lyticase)와 같은 다른 방법에 결합될 필요가 있을 수 있습니다
2 : 추출 방법의 최적화. 가장 큰 펜올 기반 방법 사이의 문제는 불완전한 계층화와 부분적 RNA 손실입니다 (표면에 뜨는 물질이 완전히 제거될 수 없습니다). 불완전한 계층화는 높은 핵산과 단백질 함량에 기인하며, 그것이 사용된 용해물의 양을 증가시키거나 표본의 양을 감소시킴으로써 해결될 수 있습니다. 클로로포름추출의 단계는 지방 조직에 추가되었습니다. RNA 손실은 백-펌핑 또는 원심분리가 이어진 유기층을 제거함으로써 감소될 수 있습니다. 가장 큰 기둥 원심 분리 기반 방법 사이의 문제는 초과 샘플입니다.
고전적 추출 팁
1. 페놀 정화 : 1시 1분 페놀 / 클로로포름의 동일 부피를 추가하고 1-2 분 동안 적극적으로 혼합되세요. 2 분 동안 고속도에 있는 원심분리기. 주의깊게 표면에 뜬 (80-90%)를 제거하세요. 결코 중간층에 도달하지 마세요. 반응 용액의 동일 부피는 페놀 / 클로로포름에 추가될 수 있고 표면에 뜨는 물질이 이동했습니다. 2개 표면에 뜨는 물질은 생산량을 향상시키기 위해 핵산 강우량을 위해 함께 섞일 수 있습니다. 혼합될 때 너무 친절하고, 모든 표면에 뜨는 물질을 제거하려고 하지 마세요.
2. 70-80% 에탄올로 지워지는 것 : 세정 동안, 핵산은 잔류염이 유실된다는 것을 보증하기 위해 보류되어야 합니다. 동시에, 바로 흘린 후 고속도에 있는 에탄올, 원심분리기는 잠시동안 그리고 나서 피펫으로 잔류 에탄올을 제거합니다. 5-10 분 동안 실온에 있는 후 소실되세요.
11. 특별한 조직의 추출
1. 섬유성 조직 : 심장과 같은 섬유성 조직으로부터의 RNA 추출의 키 / 완전히 골격근은 조직을 중단시키는 것입니다. 이러한 조직은 낮은 세포밀도를 가지고 있고 따라서 조직의 단일 가중치 당 RNA의 양이 낮고 최대한 많은 기동량을 사용하는 것은 최고입니다. 얼어붙는 날씨 하에 완전히 조직을 부수기 위해 확신하세요.
2. 고단백질 / 살찐 콘텐츠와 조직 : 뇌 / 식물성 지방 내용물은 높습니다. PCI 추출 뒤에, 표면에 뜨는 물질은 하얀 면상 침강물을 포함합니다. 표면에 뜨는 물질은 클로로포름으로 재추출되어야 합니다.
3. 높은 핵산 / 리보자임 내용물과 조직 : 비장 / 흉선은 높은 핵산과 리보자임 내용물을 가지고 있습니다. 빠른 균질화가 이어진 얼어붙는 날씨 하에 압박하는 조직은 효과적으로 리보자임을 비활성화시킬 수 있습니다. 그러나, 효과적으로 만약 용해물이 너무 끈기 있다면 (높은 핵산 함량 때문에), PCI 추출이 계층화될 수 없을 것입니다 ; 용해물이 이 이슈를 해결할 수 있는 것을 더 덧붙이기. 다수 PCI 추출은 더 나머지 DNA를 제거할 수 있습니다. 만약 백색 침전이 술을 추가한 후 바로 형성되면, 그것이 DNA 오염물을 보여줍니다. 해소 뒤에 있는 산성 PCI와 재추출은 DNA 오염물을 제거할 수 있습니다.
4. 식물 조직 : 식물 조직은 동물 조직 보다 더 복잡합니다. 일반적으로, 발전소가 유동적 질소 조건 하에 지상이어서 내인성 효소에 의한 RNA 퇴보는 드뭅니다. 만약 저하 문제가 해결되지 않으면, 그것이 거의 확실히 샘플에 포함된 음란에 의해 초래됩니다. 많은 플랜트에 포함된 음란은 잔여물로 이어질 것이고 잔여물에 대한 이유가 종종 이러한 음란이 RNA와의 약간의 유사성을 가지고 있기 때문입니다 : 당신은 촉진시키고 내가 촉진시키고 당신이 흡착되고 내가 흡착됩니다. 그들이 매우 강한 효소 저해제류라고 이러한 특성은 결정합니다.
요즈음, 상업적 RNA 추출 반응제는 미세한 조정과 거의 모든 동물 조직에 적합할 수 있지만, 그러나 대부분의 식물 조직에 적합할 수 있는 소수의 상업적 RNA 추출 반응제가 있습니다. 다행히, 포레게네는 특산 식물 RNA 추출 키트를 제공할 수 있습니다, 우리가 식물 전 rna 격리 키트를 가지고 있습니다, 식물 전 rna 차단이 게다가 장비를 갖춥니다. 후자는 특별히 높은 다당류와 폴리페놀 함량과 원전을 위해 설계됩니다. RNA 추출을 위해, 실험실 사용자들로부터의 피드백은 특히 좋습니다.
12. 줄여질 더 크고 그것이 필요로 하는 샘플 동결의 효과와 동결된 샘플이 일 수 있는 해동은 RNA 추출을 위해 있기 전에 사용했습니다. 샘플은 절단 동안 (아마 부분적으로) 녹는 경향이 있습니다. 동결된 샘플은 RNA 추출 전에 심사숙고될 필요가 있을 수 있고 해동이 분명히 이 절차 동안 발생할 것입니다. 때때로, 샘플의 해동은 또한 액화질소 밀링 공정 동안 발생합니다 ; 또는 동결된 샘플은 직접적으로 액화질소 분쇄 없이 용해물에 추가되고 해동이 분명히 완전한 균질화전에 발생할 것입니다. 동결 조직이 새로운 조직 보다 해동 동안 더 RNA 퇴보의 가능성이 높다는 것을 실험은 보여주었습니다. 유사 이유 : RNA와의 직접 접촉에 들어오기 위해 내인성 효소를 위해 그것을 더 쉬워지게 만들면서, 동결-해동 과정은 세포 이내에 구조를 와해시킵니다.
13. 보통 양질인 RNA의 의견, 전기영동이 RNA의 완전성을 판단하는데 사용되고 A260/A280이 RNA의 순도를 판단하는데 사용됩니다. 이론적으로, 완전한 RNA는 28S의 비율을 가지고 있습니다 :18S = 2.7:1과 대부분의 데이터는 28S의 비율을 강조합니다 :18S = 2:1. 사실은 거의 세포가 2시 1분 비율에 있다는 것 외에는 RNA의 어떤 것도 샘플로부터 뽑아내지 않았다는 것입니다 (이것이 아길렌트 바이오애널라이저를 사용하여 획득되었습니다).
이차구조, 전기영동 조건, 샘플 부하, EB에 의한 포화도, 기타 등등을 포함하여 RNA에 의한 전기영동 결과는 많은 요인에 의해 영향을 받습니다. RNA를 발견하고 DNA 마커를 제어로 이용하기 위해 비변성 전기 영동을 사용하세요. 2kb에 있는 28S와 0.9kb에 있는 18S가 명백하고 28S 면 : 18S > 1, 완전성이 가장 후속 실험을 위한 요구조건을 충족시킬 수 있습니다.
A260/A280은 많은 혼란을 유발한 지표입니다. 무엇보다도, 핵산을 위한 이 지표의 원의미를 명백하게 하는 것은 필요합니다 : 순수한 RNA, 그것의 A260/280 = 약 2.0. 순수한 RNA는 있습니다 그 그리고 A260/A280 = 2가 '효과' 이기 때문에'. 지금 모두는 A260/A280을 사용하고 있고로서 한 그 때문에', 자연스럽게 A260/A280 = 2 "면, 붕괴로 이어지는 그리고 나서 RNA가 순수할 " 것이라고 생각합니다.
만약 당신이 관계되면, 당신이 종종 rna 샘플에 페놀, 구아니딘 아이소티오사이아네이트, PEG, 기타 등등과 같은 추출에서 사용되는 작은 시약을 추가하고, 그리고 나서 A260/A280 비율을 측정할 수 있습니다. 현실은 샘플에서 많은 불순물뿐 아니라 A260/A280에 영향을 미치면서, RNA 추출을 위해 사용된 시약의 다수는 A260과 A280 주위에 흡수한다는 것입니다.
현재 가장 교육적 접근은 rna 샘플을 200-300 nm 범위로 스캔해 넣는 것입니다. 순수한 RNA의 곡선은 다음과 같은 특성을 가집니다 : 곡선은 매끄럽습니다, A230과 A260이 2 굴곡점입니다, A300이 0, A260/A280 = 약 2.0과 A260/A230 = 약 2.0에 가깝습니다. 만약 주사 데이터가 이용 가능하지 않으면, 이 비율이 더 효소에 의한 반응에 영향을 미치는 모든 음란의 이월에 민감한 것처럼, A260/A230 비율이 또한 결정되어야만 합니다. 장치 (A260을 위한 0.1-0.5)의 선형 범위를 고려하세요.
두가지 다른 유용한 현상이 있습니다 : 비율은 A260/A280이 물로 측정될 때 더 낮은 0.3에 대한 것일 것입니다 ; 비율이 10 밀리미터로 측정되는 동안 EDTA는 1 mM EDTA로 측정된 그것 보다 더 높은 0.2에 대한 것입니다.
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